細胞轉染是細胞生物學和分子生物學的一種常用的技術手段。而轉染效率低下卻是實驗狗們經常遇到的問題，尤其是原代細胞轉染，更是因為難度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變。不，應該是談原代細胞色變。

細胞轉染的protocol教科書和實驗手冊上面都有，毛博不想再重復了。這里，毛博根據自己做細胞轉染近10年的經驗和體會，總結出了導致轉染效率低下的八個大坑，以及避免掉坑里的一些做法。都是干貨喲。

1.準備不足

做脂質體轉染的時候，在開展正式實驗前要多做預試驗，優(yōu)化轉染條件。優(yōu)化轉染條件包括：脂質體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間等等。

2.電壓過大

做電轉的時候，如果電壓太大，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況。不同的細胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗，多摸索條件。對于大多數細胞來說，其最佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進行轉染的細胞應該處于對數生長期。處于對數生長期的細胞的抗損傷能力是最強的。細胞濃度應該處于5x10⁶到1x10⁷／mL之間。每次轉染的質粒應該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉染效率也大大降低。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細胞恢復損傷。

3.試劑過期

有時候轉染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉染整整半年，百思不得其解。最后發(fā)現，原來是Lipofectamine 2000過期了。換了之后，立馬成功。根據我的經驗，盡量使用開封半年內的Lipofectamine 2000，因為過了半年后，就算沒有過失效期，但是細胞毒性大大增加，而轉染效率卻大大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈。

4.未加血清

轉染后未及時加入血清，會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據毛博的經驗，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，最好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉染的細胞瘋狂生長。那么，什么是最佳時機呢？在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機。

5. 細胞污染

細胞污染也是造成細胞死亡，轉染效率低下的一大原因。首先，轉染細胞用的質粒必須保證無菌。而現在市場上的一般的質粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。毛博這里再貢獻一個獨門絕招：將提完質粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣就除菌了。

6.質粒不行

轉染用的質粒首先要保證數量，一般為2 μg以上。質粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質，也會影響轉染效率。這個時候，就應該對質粒進行純化和濃縮。

7.不注意細節(jié)

在轉染之前更換一次37℃預溫的培養(yǎng)基，可提高轉染效率。脂質體和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節(jié)，但是，如果不注意的話，也會造成轉染效率低下。

8.細胞狀態(tài)不好

細胞狀態(tài)不好，會導致轉染效率低下。一般進行轉染的細胞應該處于對數生長期。如果是貼壁細胞的話，貼壁率應該在70-80%；如果是懸浮細胞的話，應該是6X105個/孔（24孔板），一般是轉染前一天換液，轉染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細胞一次。轉染的整個過程都不應該有抗生素。

細胞轉染是個細活。稍微不小心，就會掉坑里。以上，毛博介紹了一些自己的心得體會。希望廣大的實驗狗們能夠避免這些毛博當年踩過的大坑，早日出成果，早日出文章。